Monkeypox Virus Real Time PCR Kit

1. UkázkaSbírka:Vzorky by měly být odebírány do sterilních zkumavek podle toho

se standardními technickými specifikacemi.

2. Příprava činidel (oblast pro přípravu činidel)

Vyjměte součásti sady, vyvažte je při pokojové teplotě pro pohotovostní použití.

3. Zpracování vzorků (oblast pro zpracování vzorků)

3.1 Extrakce nukleových kyselin

Pro extrakci nukleových kyselin se doporučuje odebrat 200 μl tekutých vzorků, pozitivní kontroly a negativní kontroly, podle odpovídajících požadavků a postupů souprav pro extrakci virové DNA.

3.2 Rozpuštění lyofilizovaného prášku a přidání templátu

Připravte lyofilizovaný premix Monkeypox Virus podle počtu vzorků.Jeden vzorek potřebuje jednu zkumavku PCR obsahující prášek lyofilizovaného premixu.Negativní kontrola a pozitivní kontrola by měly být považovány za dva vzorky.

(1) Přidejte 15 μl rozpouštěcího roztoku do každé zkumavky PCR obsahující lyofilizovaný premix, poté přidejte 5 μl extrahovaných vzorků/negativní kontroly/pozitivní kontroly do každé zkumavky PCR.

(2) Pevně ​​zakryjte zkumavky PCR, ručně protřepávejte zkumavky PCR, dokud se lyofilizovaný prášek úplně nerozpustí a nepromíchá, kapalinu odeberte na dno zkumavek PCR okamžitou nízkorychlostní centrifugací.

(3) Pokud pro detekci používáte běžný Real-time PCR přístroj, pak přímo přeneste PCR zkumavky do amplifikační oblasti;pokud pro detekci používáte BTK-8, pak je třeba provést následující operace: přeneste 10 μl kapaliny z PCR zkumavky do jamky reakčního čipu BTK-8.Jedna zkumavka PCR odpovídá jedné jamce na čipu.Během pipetování se ujistěte, že pipeta je vertikálně 90 stupňů.Špičky pipet s aerosolovou bariérou by měly být umístěny do středu jamky mírnou silou a přestat tlačit na pipetu, když dosáhne prvního rychlostního stupně (aby se zabránilo bublinám).Po naplnění jamek vyjměte reakční čipovou membránu, která zakryje všechny jamky, a čip se poté přenese do amplifikační detekční oblasti.

4. PCR amplifikace (oblast detekce)

4.1 Vložte PCR zkumavky/reakční čip do reakční nádoby a nastavte názvy každé reakční jamky v odpovídajícím pořadí.

4.2 Nastavení fluorescence detekce: (1) Monkeypox virus (FAM);(2) Vnitřní kontrola (CY5).

4.3 Spusťte následující cyklovací protokol

Protokol ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protokol BTK-8:

5. Analýza výsledků (viz uživatelská příručka k přístroji）

Po reakci se výsledky automaticky uloží.Klikněte na „Analyze“ pro analýzu a přístroj automaticky interpretuje hodnoty Ct každého vzorku ve sloupci výsledků.Výsledky negativní a pozitivní kontroly musí odpovídat následujícímu „6. Kontrola kvality“.

6. Kontrola kvality

6.1 Negativní kontrola: Žádná Ct nebo Ct>40 v kanálu FAM, Ct≤40 v kanálu CY5 s normální amplifikační křivkou.

6.2 Pozitivní kontrola: Ct≤35 v kanálu FAM s normální amplifikační křivkou, Ct≤40 v kanálu CY5 s normální amplifikační křivkou.

6.3 Výsledek je platný, pokud jsou splněna všechna výše uvedená kritéria.V opačném případě je výsledek neplatný.

Interpretace výsledků

Jsou možné následující výsledky:

POZNÁMKA: Pokud se objeví neplatný výsledek, je třeba vzorek odebrat a znovu otestovat.